农杆菌化学感受态细胞 克隆与表达

EHA105(pSoup) Chemically Competent Cell

农杆菌化学感受态细胞

产品标签：

EHA105菌株；农杆菌感受态细胞；Rifampicin（Rif） 利fu平；Kanamycin（kan）卡那mei素；EHA101；LBA4404；GV3101；AGL1；植物转基因研究；

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产品描述：

EHA105菌株由EHA101菌株改造而来，染色体背景为C58，核基因含筛选标签—利fu平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105（pTiBo542DT-DNA），此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA105（pTiBo542DT-DNA）质粒自身的T-DNA转移功能虽被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。在EHA105菌株中转入help质粒：pSoup，即得到：EHA105 (pSoup)菌株，可帮助pGreen，62SK，pGs2系列质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tetR）抗性，适用于水稻、烟草等植物的转基因操作。

我司（懋康生物）提供的EHA105 (pSoup)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，基因型为C58 (rifR) Ti pEHA105 (pTiBo542DT- DNA) Succinamopine (pSoup-tetR)，经pGs2质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

产品组分：

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，1年有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1） 感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。

2） 整个转化操作，严格根据相应温度及无菌条件要求进行。

3） 加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

4） 为确保转化效率，整个操作过程应尽量轻柔，并保持低温。

5） 转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。

6） 平板上克隆密度过大时，由于营养不足，克隆生长变慢，菌落变小。为获得大菌落，应减少质粒用量。

7） 培养基中加入利fu平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链mei素或庆大mei素可防止Ti质粒丢失，但链mei素不利于农杆菌的转基因操作，一般培养农杆菌时不考虑链mei素或庆大mei素，因Ti质粒丢失的概率极低（基本可以忽略）

8） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1) 取-80℃保存的感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，达到冰水混合状态时插入冰浴中使其完quan融化。

2) 往100μl感受态细胞悬液中加入0.01~1μg（体积不大于10μl）质粒DNA，用手拨da管底使其混匀，依次于冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。

【注意】：次使用，建议做预实验确定所加质粒的用量。

3) 加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2-3h。

4) 6,000rpm离心1min，吸掉600ul上清，之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的LB或YEB平板上，用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min，待液体被吸收后，倒置平板，28℃培养2-3天。

【注意】：当平板只含50μg/ml卡那mei素时，28℃培养48h即可；当平板中同时加入50μg/ml卡那mei素和10μg/ml利fu平时，需28℃培养48-60h；当平板中同时加入50μg/ml卡那mei素和20μg/ml利fu平时，需28℃培养60-72h；不建议使用超过20μg/ml的利fu平用于平板或液体培养。

5）目的克隆的液体培养：

j小量摇菌：往15ml的圆底透气试管中加入1ml含对应抗生素的LB液体培养基，从新鲜培养的平板上挑1-2个单菌落接种，30℃，200rpm摇菌24-48h。

k大量摇菌：100ml透气三角瓶内加入少于20ml含对应抗生素的LB液体培养基，取小摇菌液按2%比例接菌，30℃，200rpm摇菌24-48h。

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附表1固体和液体LB培养基配方

附表2固体和液体YEB培养基配方

附表3常见农杆菌对抗生素敏感性总表

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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