酵母双杂交载体是将待研究的两种蛋白质分别克隆(融合)到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域(DNA-BD)和转录激活域(AD)上，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。
酵母双杂交载体的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
反式转录激活因子，例如酵母转录因子 GAL4在结构上是组件式的(modular)，往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域(domain)构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域(activation domain，DNA-AD)。
这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
80年代的工作表明， 转录激活因子在结构上是组件式的(modular)， 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域(DNA binding domain，简称为BD)和转录激活结构域(activation domain，简称为AD)，它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
如酵母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。
在酵母双杂交系统中，"诱饵"蛋白X克隆至DNA-BD载体中，表达DNA-BD/X融合蛋白;待测试蛋白Y克隆至AD载体中，表达AD/Y融合蛋白。
一旦X与Y蛋白间有相互作用，则DNA-BD和AD也随之被牵拉靠近，恢复行使功能，激活报告重组体中LacZ和HIS3基因的表达。