AbA非常适合用作阳性克隆子筛选用的药物选择性标记。AbA抗性也是酵母单/双杂交研究中理想的报告子。本品为溶于甲醇的AbA溶液,浓度为1 mg/ml。具体的工作浓度取决于宿主细胞的敏感度(见表1. AbA对各种酵母菌的低抑菌浓度(MIC))。
金担子素A的操作步骤(抗AbA的酵母转化系统)
1)加入0.5 ml过夜培养的酵母到50 ml YPD培养基中(配方:1L液体培养基含有10g yeast extract,20g polypeptone, 20g D-glucose;固体培养基另外加入2%琼脂;)。
2)30℃培养约6小时,测定OD660为1~2。使用二倍体时,测定OD660为2~4。
3)1,000×g离心5分钟。
4)用10 ml Solution A(配方:100 mM Lithium acetate,10 mM Tris-HCl pH 7.5,1 mM EDTA)悬浮沉淀,1,000×g离心5分钟。
5)用Solution A重悬沉淀,直到OD660为150。
6)在管内分取100 µl细胞悬浮液,30℃培养1小时。
7)加入5 µg载体(环状或线性DNA)和150 µg Carrier DNA,100℃加热10分钟,迅速冷却。
注:pAUR101需使用线性DNA进行转化。使用环状DNA会降低转化效率甚至转化不成功。pAUR112和pAUR123需使用完整的质粒DNA进行转化。
8)加入850 µl Solution B(配方:取40 g Polyethylene Glycol 4000溶于100 ml Solution A充分溶解,需要现用现配),轻轻混匀。
9)30℃培养30分钟后,42℃培养15分钟。
10)室温放置10分钟。
11)5,000 rpm离心1分钟,用5 ml YPD培养基悬浮沉淀。
12)30℃培养6小时~过夜。
13)5,000~10,000 rpm离心,用1-10 ml 0.9% NaCl悬浮沉淀。
14)在YPD选择培养基平板(含有一定浓度的AbA,依菌株类型而定)上接种100 µl细胞悬液。30℃培养3-4天后转化完成。
15)挑取阳性转化子,和/或测定转化效率(以每微克质粒DNA转化的菌落数来表示)。